脂質體納米粒在臨床應用方面取得了極大的成功。無論是小分子藥物領域已經上市了二十余款制劑，還是近期RNA疫苗研制中發揮的關鍵作用，都顯示出脂質體在藥物應用領域的巨大潛力。該篇綜述聚焦于脂質體納米粒在臨床中的應用。本文為第五部分，概述了脂質體納米粒在疫苗方面的應用，并對脂質體的臨床應用進行了總結。
本文譯自Thai Thanh Hoang Thi 和 Nghia P. Truong等人的綜述 Lipid-BasedNanoparticles in the Clinic and Clinical Trials: From Cancer Nanomedicine toCOVID-19 Vaccines，Vaccines 2021, 9, 359（5.Lipid-Based Nanoparticles for Vaccines & 6. Conclusions and FutureDirections）
5. 用于疫苗的脂質納米粒
2019年底，中國湖北省武漢市出現肺炎患者。此后，2020年1月，確認引起肺炎原因是一種新型冠狀病毒，其被命名為2019-nCoV。世界衛生組織（WHO）、中國當局和其他合作伙伴致力于了解病毒的性質、來源、預防和治療。然而，COVID-19在世界范圍內空前蔓延，嚴重影響著全球經濟個體和社區健康。因此，不僅迫切需要拯救COVID-19患者，也需要開發疫苗。
基于核酸的疫苗已經得到了廣泛關注，首個核酸候選疫苗已經進入臨床試驗。與傳統的基于蛋白質的疫苗相比，核酸疫苗具有許多優勢，例如易于合成、安全、有效的抗原操縱、成本和放大能力。然而，核酸存在一些固有的缺點。DNA具有低免疫原性，可能與人類基因組整合。RNA在生理介質中迅速降解，并在10分鐘內通過腎小球濾過有效排出。盡管如此，RNA仍然被認為是開發各種疾病疫苗的最佳平臺技術，包括非傳染性疾病和傳染性疾病。體外轉錄RNA疫苗表現出有效的抗原表達，其自身也能夠實現佐劑的效果。通常在疫苗中添加佐劑以增強和延長免疫反應，但它們也有可能引起炎癥副作用。因此，RNA疫苗正在成為一種有希望的候選疫苗，其自身具有佐劑的性質，其炎癥副作用最小。用于疫苗輸送的顆粒必須具有高負載能力、可持續釋放、無泄漏，且制造簡單。為了最大限度地提高這些候選疫苗的效力以及實現人類應用的有利指標，攜帶這些制劑的載體在疫苗效力方面發揮著重要作用。對于特定疫苗，仔細考慮合適載體對于其生產具有關鍵作用。以脂質體為載體，IncoxalV、Epaxal、Mosquirix和Shingrix已成功商業化為疫苗，這些脂質體包含病毒體流感疫苗、滅活甲型肝炎病毒、RTS、S抗原疫苗和糖蛋白E疫苗。LNP已經成為疫苗設計的理想候選，它們與病毒結構相似，具有類似病毒的尺寸，并且能夠攜帶抗原和佐劑。
在疫苗的發展史中，佐劑同樣重要，其已經促進疫苗處方及其效力取得重大進展。尤其是明礬（不溶性鋁鹽）被納入許多兒童疫苗中，如DTaP（白喉、破傷風、百日咳）疫苗、肺炎球菌結合疫苗和乙肝疫苗。在2015年批準的其他疫苗中，有許多處方中包括佐劑。例如，AS01（MPL（一種天然衍生的TLR4配體）和QS21皂甙）、MF59和免疫刺激性寡核苷酸分別出現在Shingrix、Fluad和Heplisav中。此外，上市產品中還包括各種其他疫苗佐劑，包括AS04、RC-529、CpGODN、TLR9激動劑、TLR4激動劑和病毒體。這些疫苗證實，加入佐劑可以使疫苗更快、更成功地進入臨床應用。此外，據報道，許多脂質具有很強的佐劑活性。特別是陽離子脂質，二甲基十八烷基溴化銨（DDA），可以使抗原在注射部位沉積，細胞抗原內化和抗原結合增強。因此，可以預期，由DDA制備的LNP本身就具有佐劑活性。事實上，Anderluzzi等人報道，由DDA構成的聚合物納米顆粒、脂質體和固體脂質納米顆粒的乳液顯示出高抗原吸附效率、體外抗原傳遞、體內分布和高抗體反應。然而，免疫原性水平強烈依賴于處方類型。納米粒子系統顯示出較高的細胞攝取和抗原處理能力，而乳劑顯示出較高的抗體反應。
在另一個案例中，LNPs被用作佐劑和mRNA的載體系統，以實現它們在免疫刺激中的協同效應。李等人用Pam3（與五肽相連的三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酸）佐劑制備LNP，以攜帶用于癌癥免疫治療的mRNA。他們的結果表明，這種制劑觸發了不同的TLR，增加了CD8+T細胞的數量，從而阻止了腫瘤的生長。因此，LNP載體中的佐劑和mRNA的結合可能是基于mRNA的癌癥治療的一個有前景的途徑。
5.1.用于治療性疫苗的脂質納米粒
在保護能力、藥代動力學、組織分布和靶向給藥（樹突狀細胞和巨噬細胞）方面，LNPs和脂質體最適合用于基于RNA的疫苗。通過對1000多個候選藥物的優化，得出的結論是，LNP是編碼抗腫瘤疫苗抗原mRNA的合適載體。這種RNA LNP被設計用于逆轉M2樣巨噬細胞或其他免疫抑制表型，激活先天免疫，抑制其他可溶性免疫抑制因子，并誘導腫瘤浸潤性淋巴細胞，由此采用免疫調節策略治療惡性腫瘤（圖6）。事實上，許多綜述已經總結了許多與此主題相關的研究。在此，我們將重點關注已開發疫苗的臨床試驗，總結見表5。
圖6. 納米藥物采用的改善腫瘤免疫制粒的免疫調節策略
（納米藥物可以設計成誘導免疫原性細胞死亡、抗腫瘤免疫（腫瘤疫苗）、調節免疫細胞、激活固有免疫、抑制水溶性免疫抑制因子，改變腫瘤基質、工程化淋巴細胞和使血管正?；?/div>
Lipo-MERIT是一種癌癥疫苗，由編碼NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE的四種mRNA組成，這些mRNA被包裹在脂質體中，無需任何分子配體修飾。脂質體進入脾臟，被脾臟樹突狀細胞和巨噬細胞吸收，激活NK、B、CD4+和CD8+T細胞。LipoMERIT目前正處于臨床I期。
另一種處于臨床試驗中的癌癥疫苗是由ModernaTX和MerckSharp&Dohme開發的mRNALNP個性化癌癥疫苗mRNA-4157。該疫苗適用于切除的實體瘤患者，包括膀胱癌、黑色素瘤和非小細胞肺癌（NSCLC）。此外，mRNA-4157還與帕博利珠單抗聯合用于晚期或轉移性癌癥患者。給藥后，這種LNP被抗原呈遞細胞吸收和翻譯，從而誘導細胞毒性T淋巴細胞和記憶性T細胞依賴性免疫反應來破壞癌細胞。目前，mRNA-4157處于臨床I期（NCT03313778）和臨床II期（NCT03897881），評價其安全性和有效性。
EMD Serono & Merck的Stimuvax（L-BLP-25，BLP25脂質體）也進入III臨床試驗（NCT00409188）。這種治療性疫苗產生免疫，進而殺死表達糖蛋白抗原——粘蛋白1（MUC-1）的癌細胞。該試驗針對晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者，但結果令人失望，未達到主要終點。因此，L-BLP-25被終止。
5.2.脂質納米粒用于預防性疫苗——對COVID19的快速響應
2020年3月，世界衛生組織（WHO）宣布冠狀病毒傳染?。–OVID-19）是一種全球性流行病。2021年3月，全世界報告了超過1.294億例病例和280萬死亡病例。同時，2019冠狀病毒疾病有很高的幾率成為季節性疾病，感染率高，潛伏期長。因此，COVID-19疫苗的研制已成為全球人口的必需品。為此，對許多平臺進行了研究。FDA批準了12種疫苗。其他正在進行臨床試驗，目前有93種疫苗，共257項試驗，其中，29種疫苗處于臨床I期，39種疫苗處于臨床II期，25種疫苗處于臨床III期。大多數候選疫苗的激活機制是基于誘導針對刺突蛋白的中和抗體，以防止病毒通過人類血管緊張素轉換酶-2（ACE2）受體被攝取到人類細胞。到目前為止，對于mRNALNP，只有mRNA-1273和BNT162開發成功，其他的正在進行臨床試驗。
BioNTech SE和輝瑞公司為SARSCoV-2疫苗開發的包埋mRNA的LNPs有四個候選藥物（BNT162a1、BNT162b1、BNT162b2和BNT162c2）。它們由兩種核苷修飾的mRNA設計，一種含尿苷的mRNA和一種自擴增RNA。在第II期臨床試驗（NCT04380701）和III期臨床（NCT04368728）中，對18歲至85歲的健康志愿者進行了試驗。BNT162b2候選疫苗已經完成了III期臨床試驗，證明其是安全有效的疫苗。在COVID-19疫苗的緊迫需求下，輝瑞和BioNTech向FDA提交BNT162b2的緊急使用授權申請。2020年12月11日，FDA批準Pfizer-BioNTech的COVID-19疫苗在美國銷售。
mRNA-1273 COVID-19使用類似的策略，通過將mRNA包載在LNP中構建疫苗。這種合成的mRNA編碼SARS-CoV-2病毒的尖刺，即S蛋白，它是病毒表面上通過ACE2受體與宿主細胞結合的關鍵因子。SARS-CoV-2病毒的S蛋白介導細胞附著、受體識別和病毒滲透和感染的融合。該疫苗由ModernaTX開發，正在FDA批準過程中（臨床I期，NCT04283461）。它還進入了臨床II期（NCT04405076），以評估18歲以上健康男性和未懷孕女性的反應原性、免疫原性和安全性。該候選藥物已進入III期臨床（NCT04470427），以評估安全性，有效性和免疫原性，以預防COVID-19長達兩年。2020年12月17日，ModernaTX獲得了FDA對mRNA-1273的緊急使用授權。
McKay等人研究了LNP包載自擴增RNA（saRNA）作為新的SARS-CoV-2疫苗，命名為LNP-nCoVsaRNA或COVAC1。相比于傳統的mRNA，這些自我擴增的RNA結構可以更低劑量編碼和制備任何感興趣的抗原。在體外和體內實驗中，針對SARS-CoV2的LNP-nCoVsaRNA疫苗表現出強大的抗體和細胞反應。這些耀眼的結果使人們強烈相信LNP-nCoVsaRNA疫苗將提高人類的免疫原性。目前，倫敦帝國理工學院將LNP-nCoVsaRNA疫苗應用于臨床試驗，目前處于臨床I期（ISRCTN17072692）。
Duke-NUS Medical School和ArcturusTherapeutics合作共同開發了一種名為ARCT-021的COVID-19疫苗。他們使用LUNAR脂質介導的傳遞系統來包載RNA（STARRTM）。在臨床前評價中，ARCT-021已被證明是一種安全有效的COVID-19疫苗。在不使用佐劑和病毒載體的情況下，它能夠誘導CD8+T細胞和輔助性T細胞免疫應答。ARCT-021進入了I/II期臨床研究（NCT4480957），在1–10μg的多劑量水平下進行了安全性、耐受性和免疫原性評估。本研究的年齡組為18-80歲的健康人群，孕婦和哺乳期婦女除外。ARCT-021的初步數據顯示，在相對較低的劑量下具有良好的安全性。此外，其他類似的疫苗平臺，包括ChulaCov19mRNA疫苗（ChulalongkornUniversity）和SARS-CoV-2mRNA疫苗已申請臨床試驗。ChulaCov19 mRNA疫苗已注冊I期臨床試驗（NCT04566276），尚未招募病人。SARS-CoV-2mRNA疫苗已經申請中國臨床試驗注冊中心的I期臨床試驗（ChiCTR2000034112）。本試驗將評估18歲以上人群中多劑量的安全性、耐受性和免疫原性。
LNP正在開發的COVID-19疫苗不僅包括上述批準的產品或那些仍在臨床試驗中候選疫苗，而且還包括許多其他正在開發的臨床前階段的候選疫苗。世界各地許多公司、研究機構和大學已經被記載在WHO的關于RNA包載的LNP疫苗的列表中。GlobeBiotech開發了SARS-CoV-2 D614G變異體LNP包裹的mRNA。馬克斯·普朗克膠體和界面研究所（MaxPlanck Institute of Gloids and Interfaces）的LNPs包載了靶向朗格漢斯細胞的mRNA。賽諾菲巴斯德和TranslateBio研究了基于mRNA的疫苗MRT5500，并將于2020年底申請臨床試驗?，F在，MRT5500已開始I/II期臨床試驗。預計將在2021年第三季度取得中期數據。CanSinoBiologics和PrecisionNanoSystems合作開發了一種由mRNA和脂質納米粒載體組成的COVID-19RNA疫苗。第一三共公司已經開發了基于mRNA的COVID-19疫苗，命名為DS-5670。對于接下來的臨床研究中，第一三共將與東京大學合作。IMV（達特茅斯，加拿大)研制了他們的DPX-COVID-19候選疫苗。DPX是一種基于脂質的輸送系統，其中肽抗原溶解在脂質中，最終配方以干燥形式儲存。溶解后，該疫苗通過肌肉注射。注射部位沒有釋放機制，但肽抗原起到佐劑的作用，DPX可以招募抗原呈遞細胞，從而誘導淋巴結的免疫反應。張娜等研究了一種預防COVID-19病毒感染的熱穩定的mRNA候選疫苗。他們使用LNPs包載靶向SARS-CoV-2受體結合域（RBD）的mRNA。在他們使用的小鼠模型中，這種LNP誘導的中和抗體和T細胞反應對SARS-CoV-2具有高度的保護性免疫力。此外，該候選疫苗可在室溫下儲存至少一周。憑借這些優勢，該LNP-mRNA候選疫苗（RQ3011-RBD）進入在復旦大學、上海交通大學和RNACureBiopharma進行的臨床I期。此外，他們還設計了另外兩種候選疫苗，RQ3013-VLP和RQ3012-Spike，其中包括mRNA構建的混合物。RQ3013-VLP候選疫苗包含編碼S（峰）、M（膜）和E（包膜）3種病毒結構蛋白的mRNAs混合物。RQ3012-Spike疫苗攜帶編碼全長野生型S的mRNA。在小鼠模型中，RQ3013-VLP在三個候選基因中表現出最好的免疫反應，而RQ3011-RBD在2μgRNA劑量的低濃度下誘導免疫力不足。根據這些初步試驗，可以得出結論，mRNA疫苗可以作為一種靈活的平臺，有效地設計候選疫苗。
此外，針對其他疾病的疫苗開發策略仍在研究中。Shi-rai等人證明LNPs可以作為流感疫苗的佐劑。與裸露的常規季節性裂解疫苗（SV）和SV聯合明礬相比，包載SV的LNP對小鼠登革細胞的免疫刺激作用和保護能力的結果證實了這一點。LNP由1，2-二油基-3-三甲基銨-丙烷、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、N-（羰基甲氧基聚乙二醇2000）-1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和膽固醇制成。結果發現，包載SV的LNP與SV結合明礬的效率類似。明礬引起高度炎癥反應，這被認為是傳統佐劑的局限性。相反，LNP能夠誘導SV特異性免疫反應而無炎癥。斯瓦米納坦等人還評估了在小鼠模型中單獨使用LNPs和加入合成TLR9激動劑IMO-2125佐劑的LNPs的佐劑活性。該LNP配方由DSPC、膽固醇、DMG-PEG2000和不對稱可電離氨基脂質組成。令人驚訝的是，無佐劑的LNP能夠誘導B細胞對HbsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）和卵清蛋白亞單位抗原的反應，其水平與其他佐劑（包括IMO-2125、3-O-脫乙酰單磷酸脂和鋁基佐劑）相當。與單獨使用IMO-2125相比，LNP不僅能顯著增強免疫應答，而且還能誘導更高的Th1型應答。因此，LNPs和免疫調節性寡核苷酸佐劑的組合可以形成免疫應答的協同效應，獲得無機佐劑截然不同的免疫品質。
6. 結論和未來方向
脂質體納米粒技術與化療和核酸療法的臨床發展證明了脂質載體在一系列疾病治療中的潛力。然而，已上市的成功產品數量并不準確代表（預）臨床試驗中的制劑數量，這表明這些納米顆粒的開發在從動物到人類的轉化過程中仍然面臨困難和挑戰。最近，為了克服這些限制，已經開發出一些策略。為了提高納米粒的穩定性和防止藥物泄漏，脂質結構被設計成通過離子吸引與被包載治療藥物形成復合體。電離脂質，如DOP-DEDA，已證明有利于基因包載。另一方面，膽固醇對脂質體結構的穩定性至關重要，從而導致藥物的緊密包載。LNPs在生理介質和體循環中的穩定性是通過PEG脂質修飾顆粒表面實現的，從而減少網狀內皮系統的識別。然而，已有報道第一劑量給藥后產生抗PEG抗體，這會降低后續給藥的治療效果和或引起不良反應。因此，為了實現重復給藥，尋求聚乙二醇替代品對是必要的。除了長時間的循環外，LNP必須針對靶向的組織細胞器官，然后通過細胞膜內化，在作用部位釋放藥物。為了達到這一要求，LNP被設計為具有選擇性配體的智能材料，其降解由pH值、溫度或氧化還原的變化觸發。
LNP對靶細胞的選擇性結合仍然是一個挑戰。例如，核酸疫苗不能直接注射到我們的淋巴結或脾臟中，而淋巴結或脾臟是負責制造抗體和殺死癌細胞的免疫細胞所在的組織。因此，將核酸從注射部位定向輸送到淋巴結或脾臟中的免疫細胞對于最大限度地產生抗體或長壽命抗原特異性細胞毒性T細胞至關重要。這種輸送系統需要能夠靶向淋巴結，但也需要穿過淋巴結中的屏障細胞與免疫細胞相互作用。此外，在內化后，必須開始有效地向異常細胞釋放治療藥物。這些促進細胞攝取、內化和有效載荷釋放的機制尚未達到預期效果。具有選擇性配體的LNP的上市尚未成功。因此，利用各種細胞類型特異性配體和刺激劑，修正針對不同疾病的LNP，有望很快進入臨床試驗評價其有效性。與佐劑共遞送或藥物共包封是該領域的研究熱點，可以改善療效和免疫調節。此外，LNP的制造和放大生產一直具有挑戰性?；谖⒘黧w的LNP制備新方法被認為是迄今為止最穩健的方法，但它在制備多功能LNP方面存在局限性。
同時，為了COVID-19疾病的防治，RNA和LNP疫苗的快速發展已經獲得了FDA的緊急批準，這證明了這種方法能夠快速有效地響應復雜疾病。這些疫苗不僅限于傳染病，而且還用于癌癥和高脂血癥等其他疾病類型。一些臨床試驗幾乎處于最后階段。許多研究都處于早期階段，并將在未來增加，預計一系列產品將投放市場。
總之，我們相信mRNA LNP疫苗的成功為LNP技術開啟了激動人心的篇章。小分子藥物和核酸給藥的LNP制劑優化任重道遠，LNP再次成為納米藥物給藥系統的領跑者。本綜述強調了從這條漫長道路中吸取的關鍵經驗教訓，并作為設計LNP的參考。為了應對當前的全球衛生挑戰，仍然迫切需要進一步開發LNP，這需要不同領域科學家的合作努力。
參考閱讀：
臨床應用和臨床試驗中的脂質體納米粒（四）：基因治療
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